Ovlivnění fibrinolytického systému pomocí kontinuálního dopplerovského monitoringu u zdravých dobrovolníků

Souhrn

Úvod:
In vitro a in vivo studi e prokázaly, že ultrazvukové vlnění s frekvencí mezi 20 kHZ a 2 MHz urychluje lýzu trombu navozeno u trombolytiky. Cílem studi e bylo prokázat, že aplikace kontinu álního 60minutového ultrazvukového monitoringu (sono- trombolýza, ST) pomocí transkrani ální 1– 4MHz sondy vede k aktivaci fibrinolytického systému člověka, a to jak při monitorování a. cerebri medi a, tak a. radi alis.

Materi ál a metodika:

Do studi e bylo zařazeno 30 dobrovolníků, u kterých byla provedena ST a. cerebri medi a (ST‑ACM), ST a. radi alis (ST‑AR) a standardní ne urosonologické vyšetření (SNV) ve dvo utýdenních intervalech. Před ST‑ACM, ST‑AR a SNV, po 60 min a 24 hod byly vyšetřeny následující parametry: tkáňový aktivátor plazminogenu (tPA), PAI‑1 antigen, α- 2- antiplazmin (AP), plazminogen (PG), počet trombocytů, hladiny fibrinogenu, D‑dimerů, fibrin degradačních produktů (FDP), fibrinových monomerů (FM), aPTT, protrombinový čas, čas e uglobulinové fibrinolýzy, osmolalita, homocystein a lipoprotein (a). Ne urologické a fyzikální vyšetření bylo provedeno před ST‑ACM, ST‑AR a SNV, po 60 min, 24 hod, 30 a 90 dnech. Byly zaznamenány všechny nežádo ucí účinky. MR vyšetření mozku bylo u všech dobrovolníků re alizováno před zahájením ST‑ACM a 24 ± 4 hod po ukončení monitoringu. Ke statistickému zhodnocení změny mezi hodnotami sledovaných parametrů byly po užity párový Studentův t‑test, neparametrický Wilcoxonův signed rank test a Fri edmanův ANOVA test.

Výsledky:
Po ST‑ACM došlo k signifikantnímu snížení PAI‑1 antigenu o 26,6 %, AP aktivity o 5,1 %, PG aktivity o 4,3 % a tPA antigenu o 7,1 %. Po ST‑AR došlo k signifikantnímu snížení PAI‑1 antigenu o 16,8 %, AP aktivity o 3,3 % a PG aktivity o 6,7 %. Po SNV nedošlo k signifikantní změně v žádném ze sledovaných faktorů. MR vyšetření mozku neprokázalo u žádného z dobrovolníků jakékoli detekovatelné změny oproti vstupnímu vyšetření.

Závěr:
Transkrani ální dopplerovské monitorování průtoku mozkovo u tepno u a tepno u horní končetiny pomocí di agnostické duplexní transkrani ální sondy vede k přímému ovlivnění fibrinolytického systému se snížením hladin inhibitorů fibrinolýzy.

Klíčová slova:
ultrazvuk – léčba – fibrinolytický systém – transkraniální Doppler – transkraniální sonda

Úvod

Od 70. let 20. století prokázaly pokusy in vitro a in vivo na zvířecích modelech, že ultrazvukové (UZ) vlnění o frekvenci 20 kHz až 2 MHz urychluje při aplikací trombolytika lýzu trombu [1]. Z experimentálních výsledků vyplývá, že nižší frekvence mají především mechanický efekt, u vyšších frekvencí mimo jiné hraje roli pravděpodobně také aktivace fibrinolytického systému [2].

V roce 2000 byla publikována první práce [3], která poukázala na možný efekt kontinuálního transkraniálního dopplerovského (TCD) monitoringu s použitím diagnostické 2MHz TCD sondy na urychlení rekanalizace mozkové tepny a zlepšení klinického stavu u pacientů s akutním mozkovým infarktem léčených systémovou trombolýzou. Tento efekt prokázaly také další studie a v současnosti se tento terapeutický postup nazývá sono-trombolýzou (ST) [4–6]. Výsledky menších studií ukázaly také pravděpodobný efekt samotného transkraniálního monitoringu s použitím diagnostické transkraniální duplexní sondy na urychlení rekanalizace mozkové tepny u pacientů, kteří nemohli být léčeni trombolýzou [7,8].

V současnosti není plně objasněna podstata tohoto terapeutického efektu. Předpokládá se, že vlivem aplikace kontinuálního ultrazvukového vlnění dochází ke kavitaci a rozrušení struktury trombembolu s urychlením průniku intravenózně podaného trombolytika a endogenních fibrinolytických enzymů do nitra trombu s urychlením jeho lýzy [9]. Další studie naznačily, že by zde mohla hrát svou úlohu i přímá aktivace fibrinolytických enzymů a iritace cévního endotelu ultrazvukovým vlněním [10].

Cílem naší práce bylo potvrdit výsledky pilotní studie, které ukázaly, že po provedení ST – kontinuálního 60minutového ultrazvukového monitoringu pomocí diagnostické transkraniální 1–4MHz duplexní sondy s maximální energií – dochází ke změnám ve fibrinolytickém systému člověka, a to jak při monitorování a. cerebri media, tak a. radialis.

Materiál a metodika

Do studie bylo zařazeno v průběhu 12 měsíců 30 zdravých dobrovolníků, a to po 15 subjektech ve dvou neurosonologických laboratořích (Olomouc, Ostrava). Všichni dobrovolníci splnili veškerá vstupní a vylučující kritéria (tab. 1). U všech zařazených subjektů byla provedena ST a. cerebri media (ACM), ST a. radialis (AR) a standardní neurosonologické vyšetření (SNV) ve dvoutýdenních intervalech.

Provedení sono-trombolýzy

ST byla provedena pomocí standardní diagnostické transkraniální sondy s frekvencí 1–3, resp. 2–4 MHz (P1–3, Philips HD 11, Bothel, WA, USA a P4–2, Philips HDI 5000, Bothel, WA, USA), a to celkem dvakrát. Jako první byla u každého subjektu provedena ST ACM, při které byl 60 min prováděn kontinuální monitoring střední části kmene ACM. Vzorkovací objem (SV = 10mm) byl umístěn do oblasti kmene ACM v hloubce 55mm. Energie dopplerovského modu byla nastavena na maximální diagnostickou hodnotu (mechanický index [MI] = 1,4). Po dvou týdnech ST ACM byla provedena ST AR v oblasti proximálního předloktí (MI = 1,4 a SV = 10mm).

Provedení standardního neurosonologického vyšetření

SNV bylo provedeno u všech subjektů dva týdny po ST AR. Během 30 min bylo dle standardního protokolu vyšetřeno v B obraze, barevném modu a dopplerovském modu celkem 20 segmentů krčních a intrakraniálních tepen oboustranně – a. carotis communis, a. carotis interna, a. carotis externa, a. vertebralis, a. cerebri media, a. cerebri anterior, a. cerebri posterior. Na rozdíl od ST žádný z tepenných segmentů nebyl při SNV kontinuálně insonován po dobu více než 1 minuty.

Odběry, neurologické vyšetření a MR vyšetření mozku

Před ST ACM, ST AR a SNV (1. vizita), po 60 min (2. vizita) a 24 hod (3. vizita) bylo odebráno 20ml žilní krve z v. cubiti. Při ST AR byla krev odebírána z kontralaterální končetiny k monitorované AR.

V tab. 2 jsou uvedeny vyšetřované parametry fibrinolytického systému a sledované bezpečnostní parametry. Laboratorní vyšetření krevního obrazu, homocysteinu a lipoproteinu (a) bylo provedeno do 20 min od krevního odběru. Všechny vzorky odeslané ke koagulačnímu vyšetření byly ihned po odběru centrifugovány (10 min při 3 000 otáčkách a teplotě 4 °C). Sérum z každého vzorku bylo uchováno při –70 °C a laboratorně vyšetřeno do tří měsíců od odběru.

Neurologické a fyzikální vyšetření bylo provedeno před ST ACM, ST AR a SNV, po 60 min, 24 hod, 30 a 90 dnech. Všechny nežádoucí účinky byly zaznamenány včetně změny v neurologickém a fyzikálním vyšetření a nemocí vyžadujících hospitalizaci.

MR vyšetření mozku bylo u všech dobrovolníků provedeno maximálně 24 hod před zahájením ST ACM a kontrolní MR mozku 24 ± 4 hod po ukončení monitoringu. Vyšetřovací protokol obsahoval čtyři sekvence: 1. lokalizér; 2. T2TSE; 3. FLAIR; 4. difuzí vážený obraz (DWI). Byly hodnoceny jakékoli změny MR obrazu, především krvácení, ischemická ložiska a edém.

Studie byla schválena lokálními etickými komisemi FN Ostrava, FN Olomouc a FN Brno. Každý dobrovolník podepsal informovaný souhlas před zařazením do studie. Studie byla uskutečněnave shodě s Helsinskou deklarací z roku 1975 a jejími revizemi z let 1983 a 2004.

Statistika

Primárním cílem studie bylo prokázat snížení hladiny inhibitorů fibrinolýzy: inhibitoru aktivátoru plazminogenu-1 (PAI‑1) antigenu, α-2-antiplazminu a aktivity plaz-minogenu a změnu hladiny tkáňového aktivátoru plazminogenu (tPA) po 60 min ST. Sekundární cíl bylo sledovat změny v počtu trombocytů, hladinách fibrinogenu, D‑dimerů, fibrin degradačních produktů (FDP), fibrinových monomerů (FM), aPTT, protrombinového času (PT), euglobulinové fibrinolýzy, osmolality a homocysteinu a lipoproteinu (a) jako markerů poškození endotelu.

Ke statistickému zhodnocení změny mezihodnotami sledovaných parametrů naměřených při všech třech vizitách byly použity párový Studentův t‑test pro parametry s normálním rozložením hodnot (trombocyty, protrombinový čas, fibrinogen, APTT, tPA antigen, plazminogen, α-2-antiplazmin, homocystein a osmolalita) a neparametrický Wilcoxonův signed rank test pro parametry s extrémními hodnotami. (PAI‑1 antigen, fibrin degradační produkty, fibrinové monomery, D‑dimery, euglobulinová fibrinolýza a lipoprotein (a)) a Friedmanův ANOVA test. Statistické hodnocení bylo provedeno pomocí programu SPSS verze 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Hodnoty s normálním rozložením jsou uvedeny ve formě průměru ± standardní odchylky; data s extrémními hodnotami jsou uvedena ve formě mediánu a mezikvartilového rozmezí (interquartile range). Statistická signifikance byla definována hodnotou p < 0,05. Následně byla provedena také korekce dle Boferroniho pro měření čtyř parametrů.

Výsledky

Do studie bylo zařazeno 30 dobrovolníků, 15 mužů a 15 žen ve věku 50–70 let (průměr 56,1 ± 4,5 let).

Po 60 min ST ACM došlo k signifikantnímu snížení hladiny PAI‑1 antigenu průměrně o 26,6 % (p = 0,005), aktivity α-2-antiplazminu o 5,1 % (p = 0,018), plazminogenu o 4,3 % (p = 0,005) a hraničnímu snížení hladiny tkáňového aktivátoru plazminogenu (tPA) o 7,1 % (p = 0,05) s normalizací hladin do 24 hod (tab. 3, grafy 1a–d). Po Bonferroniho korekci však byly signifikantní změny jen hladiny PAI‑1 (p = 0,029) a aktivity plazminogenu (p = 0,03). Také Friedmanův test prokázal signifikantní změny hladiny PAI‑1 (p < 0,0001) i aktivity plazminogenu (p = 0,001) v prvních 24 hod.

Po 60 min ST AR došlo k signifikantnímu snížení jen hladiny PAI‑1 antigenu, a to průměrně o 16,8 % (p = 0,043), α-2-antiplazminu o 3,3 % (p = 0,009) a hladiny aktivity plazminogenu o 6,7 % (p = 0,02) s normalizací hladin do 24 hod (tab. 3). Po Boferroniho korekci byly signifikantní jen změny aktivity α-2-antiplazminu (p = 0,05). Friedmanův test prokázal signifikantní změny aktivity α-2-antiplazminu (p = 0,026) a aktivity plazminogenu (p = 0,034) v prvních 24 hod.

ST ACM ani ST RA nevedly k signifikantní změně v počtu trombocytů, hladinách fibrinogenu, D‑dimerů, fibrin FDP, FM, aPTT, PT, v čase euglobulinové fibrinolýzy, hladině homocysteinu a lipoproteinu (a): p > 0,05 (tab. 4, 5).

Po SNV nedošlo k signifikantní změně v žádném ze sledovaných faktorů ani po 60 min, ani po 24 hod: p > 0,05 (tab. 4, 5).

Průměrná změna osmolality mezi prvním a druhým vyšetřením a druhým a třetím vyšetřením byla jen 0,7 mmol/kg (0,2 %), resp. 1,6 mmol/kg (0,5 %). Ve všech případech byla změna nesignifikantní (p > 0,05; tab. 5).

MR vyšetření mozku neprokázalo u žádného z dobrovolníků žádné detekovatelné změny oproti vstupnímu vyšetření po ST ACM. Nebyly zaznamenány žádné klinické nežádoucí účinky po ST ACM ani AR.

Diskuze

Výsledky studie ukázaly, že transkraniální dopplerovské monitorování průtoku mozkovou tepnou a periferní tepnou horní končetiny (sono-trombolýza) pomocí dia­gnostické duplexní transkraniální sondy vede k přímému ovlivnění fibrinolytického systému se snížením hladin inhibitorů fibrinolýzy. Tyto výsledky potvrdily výsledky pilotní fáze [10], tedy snížení inhibitorů fibrinolýzy po ST ACM i AR. Na rozdíl od pilotní fáze dosáhl hladiny signifikantní významnosti pokles hladiny PAI‑1 antigenu, aktivity plazminogenu i α-2-antiplazminu po 60 min od zahájení ST nejen ACM, ale i AR. Změny hladin PAI‑1 antigenu a aktivity plazminogenu u ST ACM a α-2-antiplazminu u ST AR dosáhly statistické signifikance i po provedení Bonferroniho korekce. V obou případech došlo k normalizaci hladin všech tří sledovaných faktorů do 24 hod od zahájení ST. Stejně jako v pilotní fázi i nyní byl efekt výraznější při ST ACM s výjimkou snížení aktivity plazminogenu, které bylo výraznější po ST AR, avšak statisticky nesignifikantní po provedení Bonferoniho korekce. Na rozdíl od pilotní studie nebyl potvrzen tak výrazný efekt na změnu hladiny tPA antigenu, jehož pokles byl hraniční, a to jen při ST ACM. Nepotvrdili jsme také signifikantní snížení hladiny fibrinogenu ani prodloužení doby euglobulinové fibrinolýzy při ST ACM či AR.

Naše výsledky jsou ve shodě s výsledky studií na zvířatech, které prokázaly, že ultrazvukové vlnění o frekvenci 20 kHz až 2 MHz urychluje lýzu trombu, přičemž při použití nízkých frekvencí (20–100 kHz) dochází primárně k mechanickému účinku na trombus, při použití vyšších frekvencí (500 kHz až 2 MHz) dochází také k aktivaci fibrinolytického systému [2,9].

Účinek ultrazvuku na fibrinolytický systém u dobrovolníků by však šlo vysvětlit nejen přímou aktivací účinku fibrinolytických enzymů se snížením hladiny inhibitorů fibrinolýzy, ale také tím, že při aplikaci ultrazvuku dochází k aktivaci koagulace až do stadia vzniku fibrinu s možným vznikem trombu, který následně aktivuje fibrinolytický systém. V tomto případě by však došlo k nárůstu produktů spojených se vznikem a následným štěpením trombu – D‑dimerů a FDP [11]. Zároveň by však tento efekt ultrazvuku nebyl prakticky terapeuticky využitelný u pacientů s akutní okluzí tepny. Výsledky jak pilotní studie, tak výsledky prezentované studie nepotvrdily a prakticky vyloučily tuto hypotézu, jelikož po ST ACM ani ST AR nedošlo k nárůstu D‑dimerů, FDP ani FM, rovněž nebylo zobrazovacími metodami zaznamenáno zhoršení anebo novotvorba trombu.

Poprvé byl možný efekt diagnostickéhotranskraniálního dopplerovského monitoringu na urychlení rekanalizace mozkové tepny u pacientů s akutní ischemic­kou cévní mozkovou příhodou popsán Alexan­drovem et al v roce 2000 [3]. Vyšší počet časných rekanalizací mozkové tepny a rychlé úpravy neurologického deficitu byl potvrzen v následné studii CLOTBUST [4]. Poté další studie potvrdily efekt diagnostického ultrazvuku o frekvenci 1–4 MHz na urychlení rekanalizace intrakraniální tepny [5–8,12], a to jak v kombinaci se systémovou trombolýzou [4–6], tak i u pacientů, u nichž byla systémová trombolýza kontraindikována [6,7]. V těchto studiích byly použity jak dopplerovské, tak duplexní transkraniální sondy.

Předpokládají se dva možné efekty trans­kraniálního dopplerovského monitoringu na trombembolus:

1. mechanické rozrušení struktury trombembolu díky vibraci a kavitacím s urychlením průniku fibrinolytika do nitra trombu
2. aktivace fibrinolytického systému.

K tomu může dojít díky lokálnímu zvýšení teploty, stimulací endotelu nebo přímou aktivací fibrinolytických enzymů [1,3,4,7,9,10]. Z výsledků naší studie lze usuzovat, že kontinuální aplikace ultrazvuku formou ST vede k rozpadu molekulového komplexu tPA – PAI‑1 – α-2-antiplazmin. Po rozpadu této komplexní inaktivní molekuly se stává tPA aktivní s krátkým poločasem účinku [13]. Kontinuální ultrazvuková insonace pravděpodobně vede také k iritaci cévního endotelu, čímž může dojít k aktivaci fibrinolytických enzymů, které jsou podobně jako jejich inhibitory endotelovými buňkami syntetizovány [14].

Dosud není známo, jaká ultrazvuková frekvence, energie a další fyzikální charakteristiky ultrazvukového svazku vedou k nejrychlejší a nejbezpečnější rekanalizaci tepny. Z výsledků naší studie vyplývá, že efekt na fibrinolytický systém je více závislý na ultrazvukové frekvenci než jeho energii, protože při insonaci ACM i AR bylo dosaženo velmi podobných změn v hladinách sledovaných fibrinolytických enzymů, přestože v oblasti radiální tepny byla energie ultrazvukového svazku mnohonásobně vyšší než v oblasti střední mozkové tepny, díky vyšší atenuaci a reverberaci (odrazu) ultrazvukové energie při průchodu lebeční kostí a tkáněmi při hlubším uložení tepny [15].

Druhým výsledkem studie je průkaz bezpečnosti ST u zdravých dobrovolníků. U žádného subjektu nebyly zaznamenány žádné nežádoucí účinky a také na kontrolní MR mozku nedošlo k žádným detekovatelným změnám. Tyto výsledky potvrdily bezpečnost ST ve shodě s výsledky publikovaných studií u pacientů s akutní okluzí ACM léčených ST s použitím diagnostických transkraniálních sond s frekvencemi mezi 1 a 4 MHz [3,4,7,12]. Naproti tomu ve studiích, které použily sondy s nediagnostickou frekvencí 500 kHz, došlo k signifikantně vyššímu počtu intrakraniálních krvácení a porušení hemato-encefalické bariéry [16,17]. Zvýšení aktivity endogenního fibrinolytického systému v kombinaci s intravenózním podáním rtPA mohlo způsobit toto zvýšení krvácení [16]. Lze předpokládat, že snížením dávky rtPA by se mohlo v tomto případě snížit riziko intrakraniálního krvácení. Kromě rozdílně použité ultrazvukové frekvence však v těchto studiích byla i rozdílná energie ultrazvukového svazku v oblasti ischemického ložiska. K spolehlivému vysvětlení nežádoucích účinků ST při použití nediagnostických frekvencí je nutné provedení dalších studií.

Závěr

Výsledky studie potvrdily výsledky pilotní studie, že transkraniální dopplerovské monitorování průtoku mozkovou tepnou a periferní tepnou horní končetiny pomocí diagnostické duplexní transkraniální sondy vede k přímému ovlivnění fibrinolytického systému především díky snížení hladin inhibitorů fibrinolýzy. Tento efekt je pravděpodobně jedním z mechanizmů terapeutického účinku ST u pacientů s akutním uzávěrem mozkové tepny. V budoucnu je nutné provést další studie s průkazem optimální terapeutické frekvence a energie použitého ultrazvukového vlnění.

Poděkování: Studie byla podpořena grantem Interní grantové agentury Ministerstva zdravotnictví České republiky číslo NR/9487-3/2007 a částečně podpořena grantem Ministerstva školství České republiky číslo MSM 6198959216.

doc. MUDr. David Školoudík, Ph.D.
Neurologická klinika FN Ostrava
Tř. 17. listopadu 1790
708 52 Ostrava-Poruba
e-mail: skoloudik@email.cz