Matrixové metaloproteinázy v patogenezi roztroušené sklerózy

Souhrn

Matrixové metaloproteinázy představují skupinu proteolytických enzymů, jejichž aktivita je preferenčně zaměřena na extracelulární matrix. Podílí se tak na tkáňové remodelaci za fyzi ologických i patologických podmínek. Významno u roli tedy hrají i v procesu ne urozánětu, jakým je roztro ušená skleróza. Cílem článku je zmapovat dosavadní znalosti o podílu matrixových metaloproteináz v patofyzi ologii roztro ušené sklerózy a po ukázat na perspektivy možného využití těchto informací v klinické praxi.

Klíčová slova:
matrixové metaloproteinázy – roztroušená skleróza – neurozánět – krevně--mozková bariéra – extracelulární matrix

Roztro ušená skleróza (RS)

Roztro ušená skleróza je tradičně řazena mezi a uto imunitní choroby, v jejíž patogenezi hrají hlavní roli dva procesy. Je to zánět a ne urodegenerace. Jedná se o dva děje, které moho u probíhat so učasně, avšak ve většině případů podíl zánětlivých pochodů převažuje v úvodních stadi ích choroby. V so učasné době dokážeme terape uticky ovlivnit právě fázi dřívější, tedy zánětlivo u, a jejím potlačením tak oddálit výraznější změny degenerativní, jež jso u spojeny s trvalým funkčním deficitem. Důležito u skupinu prote áz, která se podílí především na kontrole zánětlivé odpovědi, představují matrixové metaloproteinázy.

Matrixové metaloproteinázy (MMP)

MMP jso u Zn‑ dependentní endopepti­dázy, jejichž proteolytická aktivita je pre­ferenčně zaměřena na extracelulární ma­trix (ECM) a podílí se na tkáňové remodelaci za fyzi ologických i patologických podmínek. Stávají se tak významným činitelem právě při zánětlivých procesech. Spolu s adamalysiny, serralysiny a astaciny patří do rozsáhlejší rodiny Zn‑ dependentních metaloproteináz, zvaných metzinciny. Poprvé je popsali Jerome Gross a Charles Lapi ere v roce 1962 u obratlovců, konkrétně u člověka. Teprve později byly prokázány i u bezobratlých a rostlin [1]. V so učasné době tvoří MMP rozsáhlo u rodinu proteináz, jež čítá nejméně 26 členů, z nichž 23 může být exprimováno u člověka (tab. 1). Klasické dělení podle substrátové specifity je řadí mezi gelatinázy, stromelysiny, kolagenázy, membránové typy a ostatní MMP (obr. 1) [1].

Aktivita metaloproteináz je vzhledem k jejich velmi závažnému účinku (rozsáhlé poškození a výrazná remodelace tkáně) velice přísně kontrolována. Tato korekce se děje na několika úrovních –  transkripce, translace, aktivace a inhibice [2]. Přímé tkáňové inhibitory metaloproteináz (TIMP) jso u známy po uze čtyři a jso u stejně jako MMP regulovány rozsáhlo u sítí signálních molekul a jejich účinek se liší dle konkrétní metaloproteinázy.

Zapojení metaloproteináz do fyzi ologických a patologických funkcí u člověka

V dospělém organizmu je exprese MMP obecně velmi nízká. Probíhá většino u po uze lokálně za specifických situ ací, jakými jso u např. remodelace a růst kostí, ovulace, menstru ace, embryogeneze, mor­fogeneze, angi ogeneze či reparace [1]. Zvýšené hladiny většiny MMP jso u však ve většině případů spojeny spíše s ději patologickými. Z ne urologických onemocnění jso u to kromě roztro ušené sklerózy i ALS (amyotrofická laterální skleróza, Amyotrophic Lateral Sclerosis), CIDP (chronická zánětlivá demyelinizační polyneuropatie, Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy), GBS (Guillainův-Barrého syndrom), vaskulární neuropatie, zánětlivá myopatie, neurodegenerace, jako jsou Alzheimerova, Huntingtonova či Parkinsonova choroba [3], ischemický iktus [4], intracerebrální krvácení [5], HIV-demence (Virus lidského imunodeficitu, Human Immunodeficiency Virus) [6] a HTLV-1 myelopatie (lidský T-buněčný lymfotropní virus typu 1, Human T-cell Lymphotropic Virus type 1) [7].

Prospěšné působení metaloproteináz v rámci nervového systému

Za fyzi ologických podmínek je role MMP nezastupitelná např. v průběhu vyzrávání mozku při procesu myelinizace, kdy byly prokázány zvýšené hladiny MMP- 9 a 12 postnatálně u myší mezi 3.– 21. dnem, které korelují právě s myelinizací [8]. So uběžně s procesem myelinizace MMP participují též na elongaci axonů a podávání rekombinantní MMP‑ 2 akceleruje růst ne uritů [9]. V průběhu vyzrávání mozku regulují migraci progenitorových buněk do cílových oblastí. V dospělém mozku zasahují MMP do regulace synaptické aktivity, podporují synaptogenezi a synapticko u plasticitu. Zapojují se tak do dějů, jako jso u učení a paměť. Jedná se především o MMP- 3 a 9, jejichž zvýšené hladiny byly prokázány na zvířecích modelech v oblasti hippocampu [10].

Velmi důležito u úloho u je zásah do reparačních procesů po úrazech, kdy podporují angi ogenezi, axonální plasticitu a regeneraci a především remyelinizaci. Je možné, že právě MMP umožňují migraci prekurzorových buněk do poraněných míst, aby zaplnily volná místa poškozených a ztracených ne uronů [9].

Metaloproteinázy a jejich role v patogenezi demyelinizačních chorob

Metaloproteinázy jso u secernovány astrocyty, mikrogli í, endotelem, T buňkami i makrofágy [11]. U remitentně relabující formy roztro ušené sklerózy se MMP podílejí téměř na všech patologických dějích. Jedná se o porušení krevně‑mozkové bari éry, perivaskulární infiltraci lymfocyty a zesílení chemotaktického gradi entu, ložiskové poškození myelinu vedo ucí ke vzniku typických RS lézí, přerušení axonů. Významné je i jejich působení ne urotoxické [12,13]. Nadprodukce metaloproteináz tak může hrát roli nejen u remitentně relabující formy, ale i v procesu ztráty ne uronů v době chronické progrese.

Matrixové metaloproteinázy a experimentální alergická encefalomyelitida (EAE)

Klasický model pro studi um patofyzi ologických pochodů u RS představuje EAE u zvířat, především myší, krys a potkanů. Ve vzorcích míchy odebraných ve vrcholné fázi onemocnění byly prokázány elevace MMP- 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 a 14 [14– 17]. Též studi e prováděné in vitro prokazují zvýšení exprese MMP jak rezidentními gli álními buňkami, tak buňkami zánětlivými, jež se nacházejí v oblasti demyelinizačních plak. Kultivované krysí astrocyty vykázaly schopnost exprese až osmi metaloproteináz. Konstitutivně byly exprimovány MMP‑ 2, 11 a 14 a po inkubaci s lipopolysacharidem došlo k expresi i MMP‑ 3, 9, 10, 12 a 13 [18]. Podávání inhibitorů MMP pak tlumí vznik a ruší klinicko u EAE v závislosti na dávce [19].

Další skupinu představují studi e využívající pro určení funkce jednotlivých me­taloproteináz zvířecí modely, jež jso u zbaveny schopnosti exprese přesně vy­braných enzymů. U myší, jež jso u de­­fek­tní pro MMP‑ 12, byla pozorována snížená schopnost makrofágů pronikat bazální membráno u in vitro i in vivo [20]. Ale i zde je patrná složitost a vzájemná propojenost jednotlivých MMP a přesné časové zařazení jejich působení. Důkazem může být práce prokazující horší průběh EAE u MMP‑ 12 defici entních myší [21]. Podkladem by mohlo být její pozitivní působení v době reparační fáze zánětlivého procesu. Stejně např. MMP‑ 2 defektní myši podléhají dřívějšímu rozvoji a závažnějšímu průběhu choroby. So učasně se u nich potvrdil i kompenzatorní nárůst MMP‑ 9 [22], jejíž zvýšené hladiny v séru, likvoru i mozkové tkáni nejčastěji korelují s progresí zánětlivých změn. Pro škodlivý vliv MMP‑ 9 svědčí též výzkumy, kdy myši neschopné exprimovat MMP‑ 9 jso u výrazně méně postiženy EAE [23]. Ale i zde je nutné nezapomínat na její možný pozitivní vliv v procesu remyelinizace.

Elevace matrixových metaloproteináz ve studi ích u paci entů s roztro ušeno u sklerózo u

Jak je patrné již ze zvířecích modelů s EAE, podíl matrixových metaloproteináz v patogenezi demyelinizačních onemocnění je zřejmý. Proto je možné najít poměrně velké množství prací, které zko umají vztah mezi zvýšenými hladinami MMP a náchylností přímo k RS. Tyto studi e můžeme rozdělit na dvě základní podskupiny. Jso u to výzkumy zabývající se zvýšeno u expresí MMP v mozkových buňkách, které byly získány z a utopsi í od paci entů s RS. Druho u podskupinu tvoří studi e sledující zvýšené hladiny MMP v mozkomíšním moku a séru a jejich zvýšeno u expresi bílými krvinkami.

Nejčastěji zko umano u metaloproteinázo u je MMP‑ 9, jejíž role je v so učasnosti považována za klíčovo u. Její zvýšená hladina byla prokázána jak v likvoru, tak v séru paci entů s RS oproti zdravým kontrolám, kde jso u hladiny nedetekovatelné. K další výraznější elevaci v séru i likvoru pak dochází u paci entů s aktivnější formo u, především v době relapsů, a tyto hladiny korelují i s nárůstem počtu lézí vykazujících enhancement po podání gadolini a na magnetické rezonanci (MRI). To odpovídá proteolytickým vlastnostem MMP, které podmiňují poškození krevně‑mozkové bari éry. V době ataky je zvýšen i poměr MMP‑ 9/ TIMP‑ 1 (fyzi ologický antagonista MMP‑ 9) [24– 26]. Zvýšená exprese MMP‑ 9 tak není kompenzována so učasným zvýšením jejich inhibitorů, ke kterému dochází např. při virových a bakteri álních meningitidách [27]. Oproti jiným ne urozánětlivým procesům, kdy jso u hlavním zdrojem tvorby metaloproteináz ne utrofily mozkomíšního moku, u paci entů s RS se hlavními producenty MMP stávají buňky centrálního nervového systému (CNS) [11].

Kromě MMP‑ 9 byla při pitvách v mozkové tkáni prokázána elevace např. MMP‑ 1, 2, 3, 7, 8 a 12, převážně v makrofázích v oblasti aktivních RS lézích [28– 30]. U astrocytů v oblasti akutních i chronických RS plak byla potvrzena exprese MMP‑ 2, 3 a 9 [30]. Jedna ze studi í prokázala u paci entů s RS dokonce zvýšeno u transkripci MMP‑ 7 a 9 ve všech mozkových lézích, kromě chronických inaktivních lézí. Tato zvýšená exprese byla so ustředěna též do míst tzv. normálně vypadající bílé hmoty [28]. Tyto poznatky jso u i jako usi paralelo u k nejnovějším MRI nálezům, jež potvrzují chronický zánětlivý proces CNS i přes klinické známky remise a podporují so učasně i představu difuzních strukturálních změn mozkové tkáně mimo oblast RS plak [31]. Zvýšené hladiny MMP‑ 9 byly potvrzeny i u paci entů s klinicky izolovaným syndromem (CIS) oproti zdravým kontrolám. Navíc však u paci entů s CIS, kde byl později potvrzen přechod do klinicky definitivní roztro ušené sklerózy (CDMS), jso u tyto hodnoty vyšší než u skupiny, kde paci enti zůstali bez dalšího ne urologického vývoje [32].

Poněkud odlišná je situ ace u formy primárně progresivní, kde je procento zánětlivých změn menší a převažuje zde především degenerace. Sérové hladiny MMP‑ 9 se jeví u těchto paci entů nižší a stejně tak i poměr MMP‑ 9/  TIMP‑ 1. I zde však koreluje jeho výše se zánětlivo u aktivito u, jež je dokumentována MRI nálezy [24,33].

Matrixové metaloproteinázy a ne urologický zánět

Jak již bylo zmíněno výše, v patogenezi roztro ušené sklerózy se vliv MMP uplatňuje na několika úrovních. Jedná se o porušení krevně‑mozkové bari éry, zesílení chemotaktického gradi entu, podpoření demyelinizace a vliv ne urotoxický, vedo ucí k zániku vlastních ne uronů.

MMP a krevně‑mozková bari éra

Je známo, že le ukocyty využívají MMP, aby mohly pronikno ut přes ECM bari éry. Takovo uto překážko u jso u i vlákna mezibuněčné hmoty, tvořící bazální membránu mozkových kapilár. K ní se dostávají lymfo idní buňky po průniku vrstvo u aktivovaných endotelových buněk. Jejich prostup dovoluje přítomnost právě MMP a jejich schopnost proteolýzy ECM. Porušení bazální membrány je následováno poškozením krevně‑mozkové bari éry. Potvrzují to studi e, kdy po intracerebrální injektáži MMP dochází k poškození právě mozkových kapilár [34]. Schopnost migrace skrze krevně‑mozkovo u bari éru je vyšší u T1 lymfocytů, jež se negativně podílejí na patogenezi choroby, oproti T2 buňkám, u kterých je tato schopnost výrazně limitována. Je to opět způsobeno vyšším zasto upením MMP‑ 9 v T1 lymfocytech oproti T2 buňkám [35].

MMP a zesílení chemotaktického gradi entu

Interakce metaloproteináz s chemokiny vede k posílení chemotaktického gradi entu a k zesílení průniku le ukocytů z tekutin CNS do mozkové tkáně. Děje se tak především konverzí inaktivních prekurzorů prozánětlivých faktorů v jejich aktivní formy. MMP‑ 7 může štěpit chemokin CXCL1, aby nasměrovala influx ne utrofilů do místa poškození [36]. MMP‑ 1, 3, 7 a 9 se moho u podílet na konverzi tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF alfa) [37]. MMP‑ 9 interaguje s interle ukinem 8, což vede ke vzniku silnějšího chemotaktického stimulu pro ne utrofily [38]. Dalšími potenci álními substráty jso u transformující růstový faktor alfa (TGF alfa), interle ukin 6, TNF receptory či selektiny, jež jso u též syntetizovány ve formě prekurzorů [9].

MMP a demyelinizace

Demyelinizace a axonální poškození zprostředkované cesto u MMP je pravděpodobně výsledkem dějů, ke kterým dochází v rámci nespecifických zánětlivých změn. V anglické literatuře bývá označovaná jako tzv. bystander demyelinizati on, tedy něco jako okolnostmi způsobená demyelinizace. Dokazují to především nálezy histologické, které vykazují určito u shodu mezi procesem demyelinizace u primárně i sekundárně progresivní RS a jiných ne urologických chorob, jakými je např. Biswangerova demence. Jedná se o nálezy z oblastí RS plak, kde dochází k poškození stěny mozkových kapilár. V nich se nachází zvýšené množství hyalinizovaného materi álu, především kolagenu IV. typu a lamininu, jež jso u hlavními substráty MMP. Dále je to přítomnost depozit komplementu v oblasti ztenčené hladké cévní svaloviny [11].

In vitro MMP poškozují myelin za uvolnění myelin bazického proteinu (MBP). Ten je hlavním proteinovým komponentem myelinových pochev a jako nejvýznamnější a uto antigen se pak stává substrátem pro další proteolyticko u aktivitu metaloproteináz. Jso u jimi MMP‑ 1, 2, 3, 7, 9, 14 [39]. Po stereotaktické injektáži MMP‑ 7, 8, a 9 dojde u zvířecích modelů nejen k porušení krevně‑mozkové bari éry, náboru le ukocytů, ale i k ložiskovému poškození myelinu [40].

Kromě demyelinizace dochází v rámci obecných zánětlivých změn v CNS i k po­škození přímo axonů, které bylo potvrzeno přímo u injektáží MMP do bílé hmoty a jež bylo blokovatelné MMP inhibitory [41].

MMP a ne urotoxicita

Metaloproteinázy se moho u na zániku ne uronů podílet několika způsoby. Může to být například přerušením navázání buněk k lamininu ECM, jež je zprostředkováno integriny a jež má za následek buněčno u smrt [42]. Další způsob představuje regulace exprese signálních molekul FasL, jež jso u spojeny s buněčno u smrtí [43]. MMP též rozsáhle interagují s okolními molekulami. Např. MMP‑ 9 s oxidem dusnatým tvoří stabilní S- nitrosylovano u MMP‑ 9, která zabíjí ne urony in vitro i in vivo [44].

Matrixové metaloproteinázy a léčba interferony

In vitro interferon beta (INF beta) snižuje u T lymfocytů produkci MMP‑ 9 a tím omezuje i jejich schopnost procházet přes ECM bari éry [45], a tak potencovat zánětlivo u fázi. In vivo, u lidí s RS po léčbě INF beta, dochází v séru k poklesu hladin MMP‑ 9 nejen na základě její snížené exprese le ukocyty, ale i přímo u inhibicí její aktivity. Jedním z potenci álních účinků INF beta tak může být právě vliv na sníženo u produkci MMP‑ 9 a so učasně i pokles MMP‑ 9/ TIMP‑ 1, jež je ještě významnější [46,47]. Stejně tak intravenózní podání vysoké dávky kortiko idů (1g Solu- Medrolu tři po sobě následující dny) v době ataky u paci entů s enhancementem po podání gadolini a na MRI vede k rychlému zvratu nadprodukce MMP‑ 9 v likvoru, neboť kortiko idy tlumí její transkripci [48]. K této redukci již však nedochází po perorálním podání (per os, p.o.) vysoké dávky kortiko idů u paci entů s retrobulbární ne uritido u a remitentně relabující RS se stejně zvýšenými hladinami MMP‑ 9 [49]. To opět potvrzuje nedostatečnost p.o. léčby kortiko idy v době ataky.

Syntetické inhibitory matrixových metaloproteináz a jejich využití v léčbě

Znalost účinků MMP a jejich zapojení do patofyzi ologických dějů u mnoha chorob vedla posléze k vývoji jejich syntetických inhibitorů. V so učasné době je již testováno několik těchto preparátů v rámci klinických studi í fáze II/ III. Farmakologicky je lze rozdělit do tří katergori í: kolagenová peptidomimetika a nepeptidomimetika, deriváty tetracyklinu a bifosfonáty [50].

Syntetické inhibitory metaloproteinázbyly původně nejčastěji testovány na paci entech s rakovino u a revmato idní artritido u. Většino u však vykazovaly jen malý účinek, což bylo podmíněno jejich malo u specificito u, jež vedla k inhibici nejen patologických, ale i fyzi ologických funkcí [50]. Batimastat (BB94) a marimastat, jež jso u zástupci 1. a 2. generace –  neselektivní se špatno u rozpust­ností, byly testovány u paci entů s rakovino u, kde se při dlo uhodobém užívání projevil jejich toxický efekt vůči muskuloskeletálnímu systému. Jednalo se především o rozvoj zánětlivých polyartritid, bolestivých tendinitid a fibrózy klo ubů. V preklinických toxikologických studi ích, kdy byly užívány vyšší dávky, se objevilo i krvácení, gastro intestinální potíže, hubnutí a peri artikulární nekrózy v oblasti kotníků a kolen [51]. Též výsledky stran léčby nedosahovaly předpokládaného efektu. Podobné vedlejší účinky byly pozorovány i u později vyvinutých tzv. nepeptidomimetických inhibitorů, které jso u charakte­rizovány již možností p.o. podání i většíspecificito u. Patří sem např. BAY 12- 9566, AG3340, BMS- 275291 či CGS- 27023A [50].

Pro využití syntetických inhibitorů v rámci léčby remitentně relabující RS se tak nabízí spíše možnost krátkodobého podávání v době ataky, ve fázi maxima destruktivního působení MMP. Omezily by se tak doposud pozorované nežádo ucí vedlejší účinky. Tato představa vychází i z výsledků pokusů, které byly prováděny u zvířecích modelů s tra umatickým míšním poškozením. Podávání syntetického inhibitoru GM6001 v prvních třech dnech po poranění vedlo ke zlepšení funkčního skóre ve 3.– 42. dni léčby [52]. Pokud však byla peri oda podávání inhibitorů prodlo užena na sedm dní, zotavení se naopak oproti normě prodlo užilo. Mohlo dojít k zablokování později se objevujících MMP, jež se pozitivně podílejí na reparaci [53]. Prolongovaná léčba inhibitory MMP s sebo u kromě rizika vedlejších účinků zmiňovaných výše nese tedy i riziko zablokování nastupujících reparačních pochodů. Pro dlo uhodobé podávání by bylo vhodné spíše využití inhibitorů vysoce selektivních (např. proti MMP‑ 9), pro fázi relapsu naopak přípravky s širším spektrem účinku.

Inhibiční aktivitu vůči MMP má též D- penicilamin a deriváty tetracyklinu, jako např. doxycyklin. Inhibiční potenci ál vykazuje i synteticky vyrobený Col– 3 [50]. Pro léčbu demyelinizačních onemocnění se však jeví nejvhodnější minocyklin, jenž byl testován na modelech s EAE, kde byl prokázán efekt na snížení exprese MMP‑ 9 v T buňkách [54]. V pilotní studii u paci entů s RS vedlo podávání minocyklinu k redukci relapsů a k poklesu počtu lézí s enhancementem gadolini a na MRI [55]. MMP‑ 9 snižuje působení interferonů jejich destrukcí, avšak kombinovaná léčba interferony s minocyklinem, který vykazuje inhibiční aktivitu vůči MMP‑ 9, by mohla vést k prodlo užení účinku interferonové léčby [56].

Kromě skupiny tetracyklinových antibi otik působí inhibičně vůči MMP též statiny či bifosfonáty. Bifosfonáty tlumí přes TGF beta 1 indukovano u sekreci MMP‑ 2 a brání degradaci kolagenu. Klodronát, jeden z nejčastěji užívaných bifosfonátů, dokáže inhibovat expresi MMP‑ 14 [50].

Závěr

O existenci matrixových metaloproteináz víme již více než 40 let, zřejmé je i jejich zapojení do patofyzi ologických pochodů v rámci chorob centrálního nervového systému, demyelinizační onemocnění nevyjímaje. Podrobněji jso u známy i ně­kte­ré dílčí funkce v jednotlivých fázích onemocnění RS, avšak přesné a komplexní chápání působení těchto prote áz zůstává skryto. Proto i snaha o léčbu s využitím dlo uhodobého podávání nespecifických inhibitorů metaloproteináz zatím skončila neúspěšně. Nezohledňuje totiž nutnost fyzi ologické, avšak velmi křehké a přísně střežené rovnováhy mezi MMP a jejich přirozenými inhibitory. Výsledkem jejího porušení pak může být na jedné straně nekon­trolovatelná destrukce tkání z důvodu nadměrného odbo urávání ECM, či naopak nežádo ucí fibrotický proces. Přestože se zde nabízejí i jiné možnosti léčby (viz výše), eventu ální využití syntetických inhibitorů MMP pravděpodobně asi nepřinese kardinální zvrat v dosavadních léčebných postupech a jejich případné po užití bude limitováno.

Přínosnější by tak mohlo být využití monitorování hladin MMP pro poso uzení aktivity choroby či zlepšení prognostiky konverze CIS v CDMS, a tak možné časnější zahájení drahé imunomodulační léčby interferony nebo kopolymerem acetátem u rizikovějších paci entů. Další možností využití by mohlo být potvrzení klinických atak v případě nejasností. Jso u to většino u případy spojené se zvýšeným psychickým či fyzickým stresem, zhoršení v době infektů či úvodní fáze nastupující ataky, jež nejso u provázeny zřejmo u progresí při objektivním ne urologickém vyšetření, přesto jso u však paci entem již vnímány jako zhoršení oproti normálnímu stavu. Pro tyto účely se nabízí především měření hladin MMP‑ 9, jež je i vzhledem ke komerční dostupnosti metodiky nejsnáze re alizovatelné. Dále by to mohla být ale i MMP‑ 3, jež byla v séru paci entů pozorována v době ataky a ještě měsíc poté, ale nikoli u paci entů v remisi [57].

MUDr. Magdaléna Hladíková

Neurologická klinika

LF MU a FN Brno

Jihlavská 20

625 00 Brno

e-mail: magdap@centrum.cz

Přijato k recenzi: 8. 4. 2008

Přijato do tisku: 14. 6. 2008