Toxické účinky pesticidů

I přesto, že v České republice jsou intoxikace organofosforovými inhibitory acetylcholinesterázy zaznamenány jen ojediněle, dle World Health Organization roční odhad celosvětově odpovídá 2 milionům. Přibližně 30 % z celkového počtu těchto otrav má vážný průběh, odhadováno je přibližně 300 tisíc úmrtí, zejména v rozvojových zemích. Vzhledem k fyzikálně-chemickým vlastnostem většiny inhibitorů acetylcholinesterázy je za jedno z nejdůležitějších cílových míst jejich toxického působení považován centrální nervový systém. V posledních desetiletích byl vliv organofosforových inhibitorů acetylcholinesterázy na tento systém intenzivně studován. Bylo potvrzeno, že poškození mozku v případě otrav organofosforovými inhibitory bývá progresivního charakteru. Na úrovni centrálního nervového systému je to zejména zánik neuronů, poškození cholinergních i necholinergních drah a degenerace axonů. Pokud dojde k inicializaci změn v mozkové tkáni, rozvíjí se kaskáda patologických dějů, které probíhají i ve velmi vzdálených časových obdobích, tedy řádově po dobu měsíců.

Klíčová slova:
acetylcholinesteráza – pesticidy – centrální nervový systém – degenerace neuronů – NMDA receptor – cholinergní systém

Úvod

Inhibitory cholinesteráz, konkrétně skupina ovlivňující funkci acetylcholinesterázy (AChE; EC 3.1.1.7), je vzhledem k jasně definované a důležité funkci tohoto enzymu v organizmu předmětem intenzivního vědeckého výzkumu. Z hlediska struktury jde o širokou skupinu látek zahrnující přírodní toxiny, látky s léčebným účinkem, pesticidy a také bojové chemické látky.

Charakteristické období pro syntézu a vývoj této skupiny toxických látek je datováno v období mezi dvěma světovými válkami, tedy do let 30. a první poloviny 40. let 20. století. Německý chemik Gerhard Schräder, který se specializoval na vývoj nových insekticidů, definoval základní chemickou strukturu látek s vysokým toxickým účinkem vůči hmyzu. Na základě těchto zjištění byl připraven první komerčně užívaný organofosforový pesticid. Následovaly studie zabývající se thiostrukturami; paraoxon a jeho thioanalog parathion byly připraveny v roce 1944 a jsou i v dnešní době považovány za jedny z nejvýznamnějších pesticidů [1].

Pesticidy jsou celosvětově široce využívány. Zejména v rozvojových zemích jsou zaznamenávány časté otravy těmito látkami, dle World Health Organization se celkový roční odhad blíží 2 milionům. Část těchto otrav má těžký průběh a přibližně 15 % končí úmrtím intoxikovaného jedince [2]. V České republice, stejně jako v jiných rozvinutých zemích, dochází k otravám ojediněle. Jsou popsány otravy dětí při neúmyslném požití roztoků obsahujících pesticidy, popřípadě suicidální pokusy. Není možné v současné době pominout ani určité riziko vojenského zneužití a narůstající nebezpečí teroristických útoků [3]. Všechny tyto skutečnosti jsou důvodem k podrobnějšímu studiu jejich biologických vlastností, zejména na úrovni centrálního nervového systému (CNS), kde se jedná o poškození progresivního charakteru.

Inhibitory AChE mohou být využity i v léčbě, vzhledem k jejich působení na centrální nebo periferní cholinergní systém. V poslední době jsou v centru lékařského zájmu především v souvislosti s Alzheimerovou chorobou a myastenia gravis. Cholinergní nervový systém zastává významnou úlohu v procesech učení a paměti. Cholinergní hypofunkce definovaná nedostatkem neurotransmiteru acetylcholinu (ACh) na neuronálních spojích v CNS zhoršuje kognitivní funkce, a představuje tak jeden z hlavních patologických podkladů vzniku demence [4]. Myastenia gravis je pak spojována s cholinergní hypofunkcí na nervosvalové ploténce [5].

Periferní cholinergní příznaky intoxikace inhibitory AChE

Příznaky intoxikace inhibitory AChE lze definovat na základě ovlivnění (hyperstimulace) příslušných cholinergních receptorů, které vznikne následkem nedostatečného odbourávání ACh v synaptické štěrbině. Cholinergní receptory se rozdělují na dvě základní skupiny, na receptory muskarinového a nikotinového typu, event. na jejich subtypy [6].

Klinické projevy akumulace ACh v parasympatických synapsích inervujících duhovku, bronchiální kmen, močový měchýř, cévy, sekreční žlázy v dýchacím a gastrointestinálním systému a také v sympatických zakončeních inervujících potní žlázy jsou obecně označovány za příznaky muskarinového typu, zatímco nahromadění Ach na zakončeních motorických nervů příčně pruhovaného svalstva a ve vegetativních gangliích za příznaky nikotinového typu. Akumulace ACh v jednotlivých strukturách mozku a míchy je příčinou centrálních příznaků otravy [7].

Periferní muskarinové příznaky intoxikace se projevují zvýšenou sekrecí exokrinních žláz –  zvýšená sekrece z nosu a v bronších, pocení, slzení a slinění. Zvýšená hladina ACh v hladkém svalstvu způsobuje miózu, poruchy akomodace, gastrointestinální obtíže se manifestují jako abdominální křeče či průjem, typické je také častější močení a bradykardie [8].

Mezi periferní nikotinové příznaky patří bledost, tachykardie a hypertenze zprostředkovaná hyperstimulací receptorů v autonomních gangliích. S tíží intoxikace výrazně souvisí míra ovlivnění příčně pruhovaného svalstva, které se při mírnějších formách intoxikace manifestuje fascikulacemi, při těžších otravách tonicko-klonickými křečemi přecházejícími v postupnou paralýzu [9]. Rozhodující je paralýza svalů podílejících se na dýchání (mezižeberní svaly a bránice).

Centrální cholinergní a necholinergní příznaky intoxikace organofosforových inhibitorů AChE

Vzhledem k fyzikálně-chemickým vlastnostem většiny inhibitorů AChE je za jedno z nejdůležitějších cílových míst jejich toxického působení považována CNS, která je chráněna hematoencefalickou bariérou (HEB). HEB zároveň omezuje prostup léčiv/ antidot do centrálního kompartmentu. Z tohoto důvodu je v posledním desetiletí zaměřena pozornost na studium prostupu léčiv přes tuto bariéru a možné ovlivnění tohoto procesu.

Ačkoli cholinergní systém zahrnuje malé procento neuronů, má velký funkční význam (obr. 1). Těla buněk, která jsou hlavním zdrojem cholinergní inervace pro oblast kůry mozkové, hipokampu a limbických struktur, jsou lokalizována v bazální části předního mozku (vč. nucleus basalis, diagonálních oblastí a septa) a v mozkovém kmeni [10]. Propojení mezi cholinergními jádry v bazální části předního mozku a mozkovém kmeni ovlivňují přímo i nepřímo aktivitu těchto vyšších center [11]. Striatum také obsahuje lokální okruh cholinergních interneuronů. Největší hustota cholinergní inervace je v komplexu nucleus caudatus-putamen [12].

Postsynaptické účinky ACh v předním mozku jsou zřejmě zprostředkovány hlavně muskarinovými receptory [12]. V mozkové kůře a limbické oblasti mají cholinergní spojení základní úlohu v učení, paměti a intelektuální aktivitě; v corpus striatum způsobuje příliš velká aktivace cholinergních interneuronů nebo nerovnováha mezi těmito neurony a dopaminergním systémem neurologické symptomy (tremor, katalepsie, stereotypní pohyby); poruchy cholinergních prvků v limbickém systému mají úlohu např. v agresivním chování apod. [11].

Expozice organofosforovými inhibitory AChE indukuje akumulaci ACh v synapsích. Ta přispívá k relativně rychlému rozvoji excitotoxicity a dysfunkci cholinergních neuronů z důvodu vysoké stimulace muskarinových receptorů. Tato hyperstimulace souvisí s narušením rovnováhy jiných neurotransmiterových systémů –  glutamatergního a GABAergního –  a následným rozvojem neuronálních excitotoxických lézí [13]. Dysfunkce cholinergních neuronů snižuje funkčnost specifických cholinergních drah v mozku s různorodými negativními důsledky: charakteristická je ztráta neuronů v cholinergních regionech, jejichž poškození se promítá do jimi inervovaných částí mozku, jako jsou bazální ganglia (piriformní kůra a entorhinální kůra) a limbický systém (hipokampus, amygdala a thalamus) [12].

Mezi akutní centrální příznaky intoxikace jsou řazeny křeče a deprese dýchání. Vznik křečí je vysvětlován hyperstimulací muskarinových receptorů. Poté je vyvolána výrazná aktivace NMDA receptorů s následným nadměrným uvolňováním glutamátu z glutamaergních neuronů vyvolávající intenzivní uvolňování vápníku v postsynaptických neuronech. Je obecně uznáváno, že křeče, které vznikají na základě dysbalance cholinergního systému, mají synergický vliv na následný rozvoj nevratných změn v mozkové tkáni s neurologickými a behaviorálními poruchami [11]. V některých studiích však bylo prokázáno, že k nevratnému poškození mozku dochází i v případech, kdy křeče nebyly zaznamenány, tedy i při velmi nízkých dávkách těchto látek, jež nevyvolávají typické příznaky otravy [14]. Tyto změny mohou být vysvětleny necholinergními účinky organofosforových inhibitorů na mozkovou tkáň.

Deprese dýchání bývá nejčastější příčinou úmrtí intoxikovaného jedince v akutní fázi otravy. Dechové centrum je uloženo v prodloužené míše. Útlum dýchání bývá potencován periferními příznaky otravy, a to zvláště paralýzou dýchacích svalů a sekrecí bronchiálních žláz [8].

Poškození mozku v případě otrav organofosforovými inhibitory bývá progresivního charakteru. Typický je zánik neuronů, poškození cholinergních i necholinergních drah a degenerace axonů [15]. Pokud jsou inicializovány změny v mozkové tkáni, rozvíjí se kaskáda patologických dějů, které probíhají i ve velmi vzdálených časových obdobích, tedy řádově po dobu měsíců [16].

Mezi sekundární procesy, nastávající řádově v hodinách po expozici organofosforovými inhibitory, které mohou indukovat rozvoj patologických změn mozkové tkáně, jsou řazeny zejména: edém mozku [17], zvýšení propustnosti HEB [18], mozkové mikrohemoragie [19], zvýšení množství intracelulárního vápníku [20], oxidativní stres [21] a zánět, popřípadě stresová odpověď [22].

Edém mozku

Edém mozku je sekundární poškození mozku, které vzniká na základě rozvoje kaskády bio­chemických a patologických procesů typických pro intoxikaci organofosforovými inhibitory AChE. Jeho výskyt ve specifických částech mozku (amygdala, piriformní část mozkové kůry, hipokampus a thalamus) velmi úzce souvisí s rozvojem dalších patologických změn a je považován za první signál, že je indukován rozvoj následného progresivního poškození mozkové tkáně a ztráta neuronů v daných oblastech CNS [23].

Zánět a změny propustnosti HEB

HEB je nutno chápat jako komplexní strukturu tvořenou několika typy buněk (obr. 2), která je charakterizována odlišnou biologickou stavbou, transportními systémy a také přítomností specifických adhezních proteinů. Kombinace všech těchto parametrů výrazně snižuje mimobuněčný (mezibuněčný) transport a výrazně zvyšuje důležitost aktivního buněčného transportu [24].

HEB se začíná tvořit v průběhu embryonálního vývoje jako důsledek prostorového vztahu mezi krevními cévami a neuroektodermálními buňkami. Tato neurovaskulární jednotka může být považována za základní funkční jednotku HEB; je definována třemi základními buněčnými subtypy: vaskulární (endotelové buňky, pericyty, buňky hladké svaloviny cév); gliální (astrocyty, mikroglie a oligodendroglie) a neuronální [25].

Zánět je přirozenou reakcí imunitního systému na poškození, typicky na zranění nebo infekci. Zánětlivá odpověď je zprostředkována aktivací makrofágů na periferii, v CNS jsou aktivovány mikroglie a/ nebo astrocyty, které se podílejí na stavbě HEB jakožto multicelulární bariéry [26,27]. Perivaskulární mikroglie jsou imunitní buňky CNS s velmi rychlou schopností odpovědi na poškození mozkové tkáně. Uvolňují působky, které se zapojují do kaskády dalších patologických změn v mozkové tkáni, např. do tvorby amyloidních plaků [28]. Cytokiny uvolňované mikrogliemi aktivují astrocyty, uvolňují se další prozánětlivé mediátory a tato reakce se šíří mozkovou tkání. Cytokiny také výrazně ovlivňují propustnost HEB, vyvolávají dilataci cév a zvýšení adheze leukocytů (neutrofilů) k cerebrálnímu endotelu a jejich migrace do místa poškození. Tím je indukována následná funkční porucha HEB [27]. Současně se lokálně zvyšuje produkce proteáz, které mohou poškozovat proteinové složky myelinu. Neutrofily indukují apoptózu buněk uvolňováním oxidu dusnatého a reaktivních kyslíkových radikálů (ROS) [26].

Po intoxikaci organofosforovými inhibitory AChE se v mozkové tkáni rozvíjí zánět. Tento proces je možné sledovat na základě změny hladin gliálního fibrilárního kyselého proteinu (GFAP), který je produkován aktivovanými astrocyty. Zvýšení jeho hladin bylo zaznamenáno v mnoha částech mozku, mimo jiné i v hipokampu, amygdale, kůře mozkové, mozečku, prodloužené míše, piriformní a entorhinální části mozkové kůry [29,30].

V případě akutní intoxikace bylo prokázáno, že úroveň zánětlivé odpovědi koreluje nejen s hladinou exprese markerů zánětu, ale také s mírou inhibice AChE v CNS a délkou trvání centrálně vyvolaných křečí [31]. V případě chronické expozice byly prokázány zánětlivé změny mozkové tkáně i v případech, kdy nebyly zaznamenány křeče a inhibice AChE, tedy typické příznaky intoxikace. Vysvětlení této aktivace je různé, jedná se o vysoce komplexní proces. Bylo např. prokázáno zvýšené uvolňování ROS a katepsinu D u makrofágů [32], zvýšení fagocytózy u makrofágů [33] nebo zvýšené uvolňování histaminu z bazofilů a žírných buněk [34].

Dále bylo prokázáno, že cholinergní systém zasahuje do regulace zánětlivé odpovědi člověka, která může být tlumena prostřednictvím stimulace bloudivého nervu (nervus vagus) a uvolňování ACh [35]. Diagram tohoto děje je zaznamenán ve schématu 1.

V případě akutních intoxikací bylo zaznamenáno také zvýšení produkce prostaglandinů a izoprostanoidů v CNS. Prostaglandiny jsou syntetizovány cyoklooxygenázami (COX) z kyseliny arachidonové uvolněné z membrán fosfolipázami [36]. Prostaglandin E2 (PGE-2) je spojován nejen se zánětem, ale i se změnami propustnosti cévních stěn, regulací krevního toku a vyvoláním hyperalgezie [36]. Izoprostanoidy, jako jsou F2 izoprostanoid a neuronálně specifický F4 neuroprostanoid, jsou odvozeny od prostaglandinů a jsou chápány jako biomarkery oxidačního stresu [37]. Izoprostanoidy usnadňují adhezi neutrofilů k buňkám endotelu, aktivované neutrofily potencují zánětlivou odpověď.

V případě akutní intoxikace organofosforovými inhibitory AChE bylo zaznamenáno zvýšení produkce PGE-2 v kůře mozkové a hipokampu [31]. Opětovné zvýšení hladin PGE-2 bylo zaznamenáno v období 1– 6 měsíců po akutní intoxikaci, kdy byla zvýšena aktivita COX-2 v neuronech hipokampu, piriformní části mozkové kůry a amygdaly [30].

Zvýšení hladiny intracelulárního vápníku

Extrémní influx vápníku vyvolaný hyperstimulací muskarinových a NMDA receptorů v mozku je považován za jeden z nejdůležitějších faktorů iniciujících odumírání neuronů. Zvýšení hladin intracelulárního vápníku bylo zaznamenáno v synaptozomech izolovaných z mozkové kůry po expozici somanem [38]. Při nadbytku iontů vápníku jsou v buňce aktivovány lipázy, proteázy, kinázy, fosfatázy a endonukleázy v metabolické kaskádě, vedoucí ke snížení syntézy proteinů buňky a deprivaci enzymových systémů důležitých k jejímu přežití [39].

Tento proces je také často výsledkem poškození volnými radikály, vlivem nadměrného oxidačního stresu nebo zánětlivé odpovědi na poškození mozkové tkáně.

Apoptóza, zánik neuronů a nervových spojů a degenerace axonů

Apoptóza je programovaný proces buněčné smrti, který velmi úzce souvisí s imunitní odpovědí organizmu na poškození tkáně. Apoptóza buněk některých oblastí mozkové tkáně je typický patologický nález progredující v časovém období odpovídajícím dvěma a více měsícům po intoxikaci organofosforovými inhibitory AChE. Charakterizována je zpravidla fragmentací jaderné DNA, buněčným scvrkáváním, tvorbou bublin na površích buněk, degradací DNA a proteinového chromatinu v jádře buňky a poškozením mitochondrií [40]. Apoptický program buňky může být aktivován také působením kyslíkových radikálů, aktivací TNF nebo Fas receptorů, poškozením DNA, popřípadě aktivací lysozomálních proteáz.

Cholinergním mechanizmem vyvolaná excitotoxicita hraje důležitou roli nejen v nastartování apoptického programu buněk, ale i v případě zániku neuronů, ztrátě nervových spojů a degeneraci axonů. Souhrnně jsou tyto patologické změny v CNS označovány jako sekundární neuronální poškození a mohou se vyskytovat 4 hod až 3 měsíce po intoxikaci v určitých částech mozku. Hipokampus a dorzolaterální jádra thalamu bývají zpravidla zasaženy 4 hod po intoxikaci, 24 hod po intoxikaci pak neuronální degenerace a edém postupuje do piriformní části mozkové kůry, 1 týden po intoxikaci jsou zaznamenávány významné ztráty neuronů v oblasti piriformního části mozkové kůry a zasažena jsou i jádra amygdaly. Přibližně 1 měsíc po intoxikaci bývá pozorována neuronální kalcifikace v oblasti thalamu a zároveň i piriformní části mozkové kůry. Hyalinní plaky, které jsou tvořeny atrofovanými zbytky buněk a jsou považovány za příznaky těžkého neuronálního poškození, jsou typicky distribuovány v oblasti hypothalamu [41,42].

Na základě rozvoje tohoto patologického stavu částí CNS lze charakterizovat následné, pozdní neurologické a neuropsychiatrické obtíže organofosfáty otrávených pacientů, které bývají často nevratné. Zdá se, že velká část těchto patologických změn může být vyvolána i subakutní intoxikací, a riziko je výrazně zvýšeno v případě opakovaných subakutních/ chronických otrav [43].

Pozdní centrální příznaky nejsou specifické a jsou popisovány jako závratě, úzkost, neklid, bolest hlavy, třes, zmatenost, ztráta koncentrace, kóma, křeče a útlum dýchání [7]. Pokud je překonána akutní fáze intoxikace, byly u některých jedinců zaznamenány změny povahy, střídání nálad, agresivní chování a psychotické epizody zahrnující schizoidní reakce, paranoiu, popřípadě se rozvíjejí dosud skryté psychiatrické problémy. Může se také zhoršit kvalita spánku, který je doprovázen nočními můrami a halucinacemi, popřípadě je rovněž zhoršena paměť a schopnost udržet pozornost [44,45].

Mezi další typické změny patří také zhoršení schopnosti propojovat informace, snížená schopnost orientace v prostoru a rozpoznávání, popřípadě snížení schopnosti dlouhodobého soustředění [46].

Celkový přehled progrese poškození CNS v případě intoxikace organofosforovými inhibitory je pro zlepšení přehlednosti shrnut ve schématu 2.

Potencionální necholinergní cílová místa účinku organofosforových inhibitorů AChE

Inhibitory AChE zasahují kromě výše popsaného do mnoha dalších biologických dějů, v současnosti se diskutuje o dalších změnách. Nejčastěji jde o ovlivnění dalších neurotransmiterových systémů, jako jsou např. serotonin, dopamin, gama aminomáselná kyselina [47]. Dochází také i k imunopatologickým změnám, anafylaktickým reakcím a změnám energetického metabolizmu mozku [46].

Některé z dalších relativně dobře dokumentovaných cílových míst, vč. jejich známých nebo teoretických funkcí, jsou shrnuty v tab. 1.

Závěr

Strategie léčby otrav způsobených inhibitory AChE, která je v současnosti doporučována, zahrnuje podání kombinace anticholinergně působící látky (atropin), antikonvulziva (diazepam) a oximu [48– 52]. Tato kombinace léčiv/ antidot je doporučována na základě znalostí hlavního mechanizmu účinku inhibitorů AChE v CNS [53].

S rozšiřováním znalostí o následných patologických procesech v CNS je možné diskutovat o možném doplnění doporučené léčebné strategie za účelem zmírnění pozdních následků intoxikace.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

doc. PharmDr. Jana Žďárová Karasová, Ph.D.

Katedra toxikologie a vojenské farmacie

Fakulta vojenského zdravotnictví

Univerzita obrany

Třebešská 1575

500 01 Hradec Kralové

e-mail: zdarova.jana@gmail.com

Přijato k recenzi: 10. 10. 2016

Přijato do tisku: 7. 11. 2016